restriction enzymes were discovered by restriction enzymes in hindi प्रतिबन्धित एन्डोन्यूक्लिएज की खोज (Discovery of Restricted Endonuclease) प्रतिबंधित एंजाइम किसे कहते है ?
प्रतिबन्धित विकर (Restriction Eæymes)
प्रतिबन्धित विकर में मुख्यतया एन्डोन्यूक्लिएज ऐसे एन्जाइम होते हैं जो डीएनए के फोस्फोडापत बन्ध को जलीय अपघटन (hydrolyse) द्वारा नष्ट कर देते हैं। फलस्वरूप डीएनए का विभिन्न खाले में विदलन (cleavage) हो जाता है। प्रतिबन्ध एन्डोन्यूक्लिएज इसी प्रकार का विशिष्ट एन्जाइम है जो एन्डोन्यूक्लिएज का उपसमूह (sub group) कहलाता है।
प्रतिबन्ध एन्डोन्यूक्लिएज (restrictionendonuclease) डीएनए के दोनों सूत्रों पर विशिष्ट न्यूक्लियोटाइट अनुक्रम को चिन्हित करके वहां पर मौजूद फोस्फोडाइएस्टर बन्ध को जलीय अपघटन (hydrolveal करके कट (cut) लगा देते हैं। इस विदलन (cleave) के कारण डीएनए के विभिन्न आकार के खण्ड प्राप्त होते हैं। इसमें मुख्य बात यह है कि एक समूह के सभी खण्डों का अनुक्रम एक समान ही होगा। एक ही विशिष्ट अनुक्रम पर कट लगाने वाला यह एन्जाइम आगे चलकर डीएनए क्लोन में महत्वपूर्ण सिद्ध हुआ। इस एन्जाइम की खोज स्मिथ, नाथन्स तथा आर्बर (Smith, Nathans and Arber) ने की जिन्हें बाद में 1978 में कार्यिकी एवं मेडिसीन के नोबेल पुरस्कार से नवाजा गया।
प्रतिबन्धित एन्डोन्यूक्लिएज की खोज (Discovery of Restricted Endonuclease)
इस प्रतिबन्ध एन्डोन्यूक्लिएज की खोज बैक्टीरियोफॉज के परपोषी प्रतिबन्ध के कारण संभव हो सकी। ई.कोलाई की दो समुदाय (population) जैसे स्ट्रेन B तथा स्ट्रेन (strain) K12 पर जब फॉज P को संवर्धित किया गया तो पाया कि यह दोनों स्ट्रेन B तथा K12 पर आसानी से संवर्धित हो जाते है। परन्तु जब स्ट्रेन ठ पर संवर्धित फॉज P को लेकर स्ट्रेन K12 पर संवर्धित किया जाता है तब अधिकतर डीएनए तेजी से विघटित (degraded) होने लगते हैं। मात्र कुछ ही फॉज संतति (progeny) उत्पन्न कर पाते हैं।
आश्चर्यजनक रूप से शेष बचे फॉज द्वारा उत्पन्न संतति यदि पुनः स्ट्रेन K12 को दोबारा संक्रमित करती है तो यह बिना किसी विघटन के प्रतिकृतिक होने लगती है। इसी तरह से यदि स्ट्रेन K12 पर आसानी से प्रतिकृतिक होने वाले फॉज P को स्ट्रेन B पर संवर्धित किया जाये तो इसमें भी फॉज P का डीएनए तरन्त विघटित हो गया। स्ट्रेन K12 कोशिकाओं में प्रतिकृतिकरण (replication) ने फॉज का रूपान्तरित कर दिया जिसके फलस्वरूप यह मात्र स्ट्रेन K12 कोशिकाओं में ही प्रतिकति बनाने में सक्षम रह गया।
इससे यह साबित हुआ कि जब फॉज को दो भिन्न स्ट्रेन में बारम्बार स्थानान्तरित किया गया तब इसने परपोषी के प्रति प्रतिबन्ध दर्शाया। यह निष्कर्ष निकाला गया कि फॉज के डीएनए में तो कोई परिवर्तन नहीं होता परन्तु यह किसी तरह से रूपान्तरित हो जाता है।
लिन तथा आबेर (Linn and Arber) ने बाद में 1960 में साबित किया कि फॉज का ई.कालाई परपोषी प्रतिबन्ध निम्न दो एन्जाइम के कारण हुआ-
(1) मिथाइलेटेड डीनएन-डीएनए मिथाइलेज (Methylated DNA-DNA methylase)
(2) अमिथाइलेटेड डीएनए जिसे प्रतिबन्ध एन्डोन्यूक्लिएज कहते हैं ।
(Non Methylated DNA-now called as restriction endonuclease)
यहां खास बात यह है कि डीएनए का मिथाइलेटेट प्ररूप (methylated form) प्रतिबन्ध एन्डोन्यूक्लिएष् द्वारा प्रभावित नहीं होता है व इसमें लगे मिथाइल समूह. विशिष्ट क्षार पर संलग्न होकर डीएनए की रक्षा करते हैं।
जीवाणु कोशिका का स्वयं का डीएनए तथा इसमें उपस्थित कोई भी बाह्य डीएनए (foreign DNA) मिथाइलेटिड हो कर प्रतिबन्ध एन्डोन्यूक्लिएज से अपने आप को विलगित (cleave) होने से बचा सकता है।
पहचान के विशिष्ट क्षारक अनुक्रम (Recognition by special base sequences)
पेलिन्ड्रोम वह शब्द होते हैं जिन्हें बायें से दायें अथवा दायें से बायें पढ़ने पर एक समान नजर आये जैसे-
MOM
MADAM, I’MADAM
BOB
प्रतिबन्ध एन्जाइम सामान्यतया डीएनए के छोटे अनुक्रमों को चिहिन्त करते हैं जो कि पेलिन्ड्रोम (चंसपदकतवउमे) होते हैं । यह पेलिन्ड्रोमिक अनुक्रम के मध्य स्थित क्षार पर विदलन (cleave) करते हैं!
सबसे पहला प्रतिबन्ध एन्डोन्यूक्लिएज एन्जाइम हैमिल्टन स्मिथ ने 1970 में इसके विशिष्ट अनुक्रम सहित प्रस्तुत किया। इसे उन्होंने भ्पदक प्प् नाम दिया यह डीएनए के पिरिमिडीन एवं प्यूरीन अवशिष्ट (residues) पर कट लगा कर विदलन (cleave) करता है।
↓
, 5′-G-T-Py – Pu-A-C-3′ पेलिन्ड्रोमिक अनुक्रम
3′-C-A-Pu-Py-T-G-3′
↑
5′-G-T-Py Pu-A-C-3′
3′-C-A-Pu Py-T-G-5′
यहां तीर (arrow) प्रतिबन्ध एन्डोन्यूक्लिएज एन्जाइम भ्पदक II द्वारा पिरीमिडीन (Py) तथा प्यरीन (Pu) के मध्य लगे कट को दर्शा रहा है। इस स्थान से डीएनए विदलित (cleaved) हो जाता है।
ई.कोलाई से विलगित रेस्ट्रिक्शन एन्डोन्यूक्लिएज एन्जाइम म्बवत्प् डीएनए खण्ड के निम्न अनुक्रम पर कट लगता है।
↓
G-A-A-T-T-C
C-T-T-A-A-G
↑
प्रतिबन्धित एन्डोन्यूक्लिएज एन्जाइम के नाम का निर्धारण
(Nomenclature of Eæyme Restricted Endonuclease)
आज अनेक प्रकार के प्रतिबन्ध एन्जाइम का आविष्कार हो चुका है। इनके नामकरण के लिए कुछ नियम बनाये गये हैं जिसके द्वारा इन्हें आसानी से पहचाना जा सकता है। यहां उदाहरण स्वरूप EcoRI को लेकर इसके नामकरण को आसानी से इस प्रकार समझा जा सकता है।
(1) प्रतिबन्ध एन्डोन्यूक्लिएज का पहला अक्षर उस जीनस (genus) का प्रथम अक्षर के आधार पर रखा जाता है जिसमें से इस एन्जाइम की सर्वप्रथम खोज हुई थी। यह सदैव केपीटल एल्फाबेटध्बड़े अक्षरों (capital alphabet) में लिखा जाता है।
म्बवत्प् अक्षर में बैक्टीरिया ई.कोलाई (E.k~ coli) के प्रथम अक्षर से लिया गया है तथा केपीटल में लिखा गया है।
प्रतिबन्ध एन्डोन्यूक्लिएज एवं पेलिन्ड्रोम अनुक्रम के अन्दर एवं बाहर विदलन
क्र.सं. प्रतिबन्ध एन्डोन्यूक्लिएज
(Restriction endonuclease) स्रोत (Source)
चिन्हित अनुक्रम
(Recognçation sequence)
1. म्बवत्प् इशरिसिया कोलाई RY13 (Escherichia coli RY13) G/AATTCCTTAA/G
2. Hind III हीमोफीलिया इन्फ्लुएन्जी Rd (H- Influeæae Rd) A/GCGTTTTCGA/A
3. Hind p II हीमोर्फीलिया इन्फ्लुएन्जी Pr (H- Influeæae Pi) G/GCCCCG/G
4. Nla III नेसरिया लैक्टेमिका (Neisseria lactamica) CTAG/k~ /GATC
5. Sau 3A II स्टैफिलोकोकस आरिएस 3A (Staphylococus aureus 3A) /GTAc~ CTAC/
6. Taq1 थर्मस एक्वेटिकस YTI (Thermus aquaticus YTI) T/CGA AGC/T
(2) एन्जाइम का दूसरा एवं तीसरा अक्षर उस जीव की जाति का पहला व द्वितीय अक्षर है जिससे सम्बन्धित एन्जाइम की खोज हुई थी। यह छोटे एल्फाबेट में लिखा जाता है।
EcoRI में द्वितीय एवं तृतीय अक्षर बैक्टीरिया ई.कोलाई (E- coli) की जाति कोलाई के प्रथम दो अक्षर बव हैं जो छोटे एल्फाबेट में लिखे जाते हैं।
(3) जीनस एशरिशिया (Genus Escherichia) जिसका प्रथम अक्षर E तथा जाति-कोलाई (species coli) के प्रथम दो अक्षर co अर्थात प्रथम तीन अक्षर (Eco) सदैव तिर्यक अक्षरों-इटीलक्स (Italics fonts) में लिखे जाते हैं जैसे यदि जीव Escherichia coli है तो इसके लिए Eco का प्रयोग इलेलिक्ट फोन्ट (italic fonts) में करेंगे।
(4) जीन के नाम के आगे (प्रथम तीन अक्षरों के पश्चात) प्लाज्मिड, विभेद (strain) अथवा प्ररूप (type) का नाम लिखा जाता है। उदाहरणार्थ यदि प्लाज्मिड में स्थित जीन का उपयोग हुआ है तो प्लाज्मिड R1 का प्रयोग जीन के नाम के प्रथम तीन अक्षरों के आगे इस प्रकार लिखा जायेगा। Eco R1. यह जीव जिसमें एन्जाइम की सर्वप्रथम खोज हुई उसके इटेलिक्स फॉन्ट के प्रथम तीन अक्षरों के पश्चात् साधारण अक्षरों (R1) जो तिर्यक नहीं हो में लिखा जायेगा।
प्रतिबन्धित एन्डोन्यूक्लिएज के कट विस्थल (Cut sites of Restriction Endonuclease)
प्रतिबन्ध एन्डोन्यूक्लिएज किन्हीं विशिष्ट क्षार अनुक्रमों पर ही कट करके विदलन (cleavage) करते हैं। इनके विदलन हेतु निम्न विशेषतायें होती हैं
1. कट सदैव पेलिन्ड्रोम अनुक्रमों (pallindromic sequence) पर ही लगते हैं जो दायें-बायें पढ़ने- में एक समान हों।
2. अधिकतर प्रतिबन्ध एन्डोन्यूक्लिएज डीएनए अणुओं को चिन्हित स्थल (recognition site) के अन्दर ही कट करते हैं उदाहरण Eco RI, Hind II
3. कुछ प्रतिबन्ध एन्डोन्यूक्लिएज डीनएन अणुओं के लक्ष्य स्थल (target sites) के एकदम बाहर कट लगा कर विदलन (cleavage) करते हैं।
4. कट निम्न दो प्रकार से लगता है (I) सम स्थल पर (even site) (II) असमान स्थलों पर जिस सांतरित विदलन (staggered cleavage) कहते हैं।
5. सम स्थल पर कट लगने पर डीएनए अणु के दोनों सूत्रों पर एक ही स्थान पर कर्तन (cut) होता है जिससे सपाट कुंठित (blunt) सिरे उत्पन्न होते हैं।
5’k~ GAA ↓ TTC3’k~ isfyUMªkse vuqØe
3’CTt~ ↑ AAG5′
6. सान्तरित (staggered) विदलन (असमान कर्तन) द्वारा डीएनए अणु के दोनों सूत्रों पर अलग-अलग स्थलों पर कर्तन (cut) होता है जिससे एक सूत्र दूसरे सूत्र से कुछ क्षारक अधिक बड़ा कटता है फलस्वरूप बहिःसरित सिरे (protruding ends) उत्पन्न होते हैं। ऐसे असमान सिरों को अनुलग्न (sticky) अथवा ससंजक (cohesive) सिरे कहते हैं।
7. इन अनलग्नी सिरों की खासियत होती है कि यह एक दूसरे से सिरे पर शीघ्रता से संलग्न हो जाते हैं जो पुनर्योगज डीएनए उत्पन्न करने में सहायक होते हैं।
प्रतिबन्ध एन्डोन्यूक्लिएज द्वारा लगाये गये तीन विभिन्न प्रकार के कट
एन्जाइम
ब्लन्ट कट
(Blunt cut) जीवाणु का स्रोत चिन्हित अनुक्रम चिन्हित
न्यूक्लियोटा
Hpal हीमोफिलस पेराइन्फ्लुएन्जी
(Haemophilus paraiflueæae) 5.GTTi~ ↓ AAC-3′
3CAA ↑ TTG-5′
6
3′ बहिसारित सिरा (Protruding end)
Hae III हीमोफिलस इजिप्टिकस
(Haemophilus aegypticus) 5′-GCG↓C3′
3-C↑ GCG-5’k~ 4
5′ बहिसारित सिरा (Protruding end)
ECORI इशरिसिया कोलाई (Echerichia coli) 5.G↓AATTC-3′
3-CTTAA↑ G-5’k~ 6
रेस्ट्रिक्शन एन्जाइम द्वारा उत्पन्न सपाट.सिरों में परिवर्तन (Change in blunt ends produced by Restriction Eæyme) ऋप्रतिबन्धित एन्जाइम द्वारा डीएनए के सिरों पर स्थित स्वतंत्र -OH समूह (3′) तथा फोस्फेट समूह (5′) को हटा कर इनके स्थान पर आवश्यकतानुसार परिवर्तन किया जाता है।
1. रेस्ट्रिक्शन एन्जाइम द्वारा उत्पन्न सपाट सिरों को ।-T पुच्छन द्वारा ससंजक सिरों में परिवर्तन करना।
2. रेस्ट्रिक्शन एन्जाइम द्वारा उत्पन्न सपाट सिरों को लिंकर्स द्वारा ससंजक सिरों में बदलना
प्रतिबन्धित एन्डोन्यूक्लिएज के अनुप्रयोग
(Application of Restriction Endonuclease)
1. रेस्ट्रिक्शन एन्डोन्यूक्लिएज एक औजार (कैंची) की तरह प्रयोग होता है जो डीएनए खण्ड में किन्हीं विशिष्ट अनुक्रमों पर कट (nick) लगा कर उन्हें विखण्डित कर देता है।
2. बाह्य डीएनए खण्ड व वाहक के डीएनए को एक ही रेस्ट्रिक्शन एन्जाइम से काटने पर वह एक दूसरे के पूरक होने से आसानी से जुड़ (ligate) हो जाते हैं।
3. जिस स्थल पर जीन जाकर जुड़ेगा उस स्थल की पहचान करने में सहायक होते हैं।
4. डीएनए अणु को सूक्ष्म खण्डों में काटने पर विशिष्ट जीनध्वांछित जीन की स्थिति का ज्ञान करने में सहायक हैं।
प्रश्न (Questions)
(।) बहुविकल्पी प्रश्न (Multiple Choice Questions)
1. कौन से एन्जाइम डीएनए को खण्डित करते हैं-
(ं) टाइप II रेस्ट्रिक्शन एन्डोन्यूक्लिएज (इ) लाइगेज
(ब) पॉलीमरेज (क) सभी
Which eæyme can fragment DNA
(a) Type II Restriction Endonuclease (b) Ligase
(c) Polymerase (d) All
2. डीएनए को जोड़ने वाले एन्जाइम है-
(ं) एन्डोन्यूक्लिएज (इ) लाइगेज
(ब) पॉलीमरेज (क) कोई नहीं
Which eæyme helps in binding DNA
(a) Endonuclease (b) Ligase
(c) Polymerase (d) None
3. रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज एन्जाइम किस वायरस में होता है-
(a) TMV (b)पीत मोजेक वायरस
(c) रिट्रोवायरस (क) सभी में
In which virus reverse transcriptase eæyme is present
(a) TMV (b) Yellow mosaic virus
(c) Retrovirus (d) All
4. डीएनए के फोस्फोडायस्टर बंध का कौनसा एन्जाइम जलीय अपघटन करते है-
ं(ं) एन्डोन्यूक्लिएज (इ) लाइगेज
(ब) पॉलीमरेज (क) सभी
Which eæyme hydrolyses phosphodiester bond of DNA
(a) Endonuclease (b) Ligase
(c) Polymerasae (d) All
5. पहला प्रतिबंध एन्डोन्यूक्लिएज किसने रिपोर्ट किया-
(ं) हैमिल्टन स्मिथ (इ) लिन व आर्बर
(ब) कैरी मुलिस (क) कोई नहीं
First restriction endonuclease was reported by
;a) Hamilton Smith (b) Linn and Arber
(c) Karry Mulis (d) None
उत्तर (Answer)
1. (a), 2. (b) 3.(c), 4.(ad), 5. (ea)
(ठ) रिक्त स्थान भरिए (Fill In the Blanks)
1. ………, ……., ……. आदि का कार्य डीएनए जीन को क्लोन करना है।
——————————etc.k~ act as vector for DNA cloning.
2. सी-डीएनए एन्जाइम ……….. की उपस्थिति में तैयार होते हैं।
c-DNA are prepared in presence of eæyme ……………….
3. प्रतिबंधित एन्डोन्यूक्लिएज के कट सदैव ……. अनुक्रमों पर लगते हैं।
Restriction endonuclease always cleaves the …………..k~ sequences-
4. वह शब्द जो बायें से दायें पढ़े जा सकें ………. कहलाते हैं।
Words which can be read from left to right.
5. …………..द्वारा डीएनए अणु के अलग-अलग स्थानों पर कट लगता है।
By ……….k~ DNA molecule is cut at dffierent sites.
उत्तर (Answer)
1. प्लास्मिड, कॉरिमड, बैक्टीरियोफॉज (Plasmid, cosmid, Bacteriophage),
2. रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस (Reverse transcriptase), 3. पेलिन्ड्रोम (Palindrome), 4. पेलिन्ड्रोम (Palin drome)
5. सांतरित विदलन (staggered cleavage),
(ब्) सत्य ध्असत्य (True or False)
1. पुनर्योगज तकनीक में प्लास्मिड वाहक का कार्य करते हैं।
In recombination technique plasmid act as vector.
2. जीन क्लोनिंग प्रक्रिया में डीएनए पॉलीमरेज आवश्यक है।
During gene cloning process eæyme DNA polymerase is essential.
3. डव्ड पेलिन्ड्रोम शब्द है।
MOM is a palindrome word.
4. प्रतिबंध एन्डोन्यूक्लिएज विशिष्ट क्षारक्रमों पर कट लगाते हैं।
Restriction endonuclease nicks only at specific base sequence.
उत्तर (Answer)
1. सत्य (True), 2. सत्य (True), 3. सत्य (True), 4. असत्य (False)
(क्) लघुत्तरात्मक प्रश्न (Short Answer Type Questions)
1. पुनर्योगज डीएनए तकनीक का कार्य लिखिये।
Write the function of recombinant DNA technique.
2. डीएनए पॉलीमरेज का कार्य लिखिये।
Write the function of DNA polymerase.
3. प्राकृतिक वाहक का नाम लिखिये।
Nature natural vectors.
4. डॉट ब्लाट तकनीक का क्या कार्य है ?
What is the function of dot blot technique?
(म्) टिप्पणियां लिखिये (Write short notes)
1. c-DNA लाइब्रेरी
c-DNA library
2. डीएनए क्लोनिंग वाहक
DNA cloning vectors
3. प्रतिबंधित एन्डोन्यूक्लिएज एन्जाइम नाम निर्धारण पर टिप्पणी लिखिये।
Write a short note on nomenclature of restrict enconuclease.
4. प्रतिबंधित एन्डोन्यूक्लिएज के कट विस्थल पर टिप्पणी लिखिये।
Write a short note on cut sites of restriction endonuclease-
5. प्रतिबन्धित एन्डोन्यूक्लिएज के अनुप्रयोग पर टिप्पणी लिखिये।
Write a short note on application of restriction endonuclease-
6. कॉलोनी संकरण
Colony hybridçaiotn.
7. ऑटोरेडियोग्राफी
Autoradiography.
8. पुनर्योगज तकनीक के अनुप्रयोग।
Applications of recombinant technique.
(थ्) निबन्धात्मक प्रश्न (Essay Type Questions)
1. पुनर्योगज डीएनए तकनीक पर लेख लिखिये।
Write an essay on recombinant DNA technique.
2. प्रतिबंध विकर पर एक लेख लिखिये।
Write an essay on restriction eæyme.